Высота

Nature Communications, том 13, номер статьи: 2919 (2022) Цитировать эту статью

9202 Доступа

18 цитат

21 Альтметрика

Подробности о метриках

Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры — мощные инструменты, используемые для отслеживания химических процессов в неповрежденных биологических системах. Однако разработка и оптимизация биосенсоров остается сложным и трудоемким процессом, в первую очередь из-за технических ограничений методов скрининга потенциальных биосенсоров. Здесь мы описываем метод скрининга, который сочетает в себе капельную микрофлюидику и автоматическую флуоресцентную визуализацию, чтобы обеспечить увеличение производительности скрининга на порядок. Более того, в отличие от современных методов, которые ограничиваются одновременным скринингом одной функции биосенсора (например, яркости), наш метод позволяет параллельно оценивать несколько функций (например, контрастность, аффинность, специфичность). Поскольку функции биосенсора могут меняться, эта возможность необходима для быстрой оптимизации. Мы используем эту систему для создания высокопроизводительного биосенсора лактата, который можно использовать для количественного определения внутриклеточной концентрации лактата. Этот биосенсор, названный LiLac, представляет собой значительный прогресс в распознавании метаболитов и демонстрирует мощь нашего подхода к скринингу.

Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры являются важным инструментом для изучения метаболизма. Их флуоресцентный сигнал обеспечивает высокое временное разрешение как в быстрых временных масштабах, так и во время хронической визуализации1,2,3,4,5, а поскольку они генетически закодированы, они могут напрямую экспрессироваться в живых клетках и нацеливаться на определенные типы клеток и органеллы6,7. . Поскольку отдельные клетки могут быть метаболически различны, а метаболиты перерабатываются с высокой скоростью8,9, биосенсоры позволили уникально точно измерить в отдельных клетках базовые метаболические состояния и метаболические возмущения в ответ на вызов или стимул1,10.

Для количественной оценки концентраций метаболитов показания флуоресцентного биосенсора должны быть i) настроены на физиологические концентрации целевого лиганда, ii) высокоспецифичны для этого лиганда и iii) устойчивы к изменениям клеточной среды (включая pH) и уровня экспрессии. самого биосенсора. Единственный способ разработать такие высокопроизводительные биосенсоры — это их скрининг, анализ множества отдельных вариантов из больших библиотек биосенсоров, поскольку они подвергаются воздействию многих концентраций лигандов и условий.

Это создает проблему для биосенсорного скрининга. Несмотря на впечатляющие достижения в разработке новых платформ для разработки флуоресцентных белков и биосенсоров7,11,12,13,14, существующие экраны по-прежнему ограничены в количестве условий, в которых можно протестировать биосенсор. Здесь мы преодолели эти ограничения, увеличив содержание и производительность скрининга на порядки, объединив капельную микрофлюидику и автоматизированную двухфотонную флуоресцентную визуализацию времени жизни (2p-FLIM). Время жизни флуоресценции представляет собой среднее время между поглощением и испусканием фотонов, а датчики времени жизни стали высокоэффективными инструментами для количественного определения уровней малых молекул в интактных клетках7,15,16. Здесь мы использовали полупроницаемые гели, полученные микрофлюидным способом, называемые шариками с гелевой оболочкой (GSB)17, которые служат микродиализными камерами, и использовали их для анализа тысяч независимо изолированных вариантов сенсоров на весь срок службы в отношении множества различных условий, одновременно оценивая сродство, специфичность и реакцию. размер.

Мы также показываем, как нашу систему скрининга BeadScan можно использовать для быстрой разработки и оптимизации генетически закодированных флуоресцентных биосенсоров. В качестве демонстрации возможностей нашего экрана мы использовали BeadScan для создания высокопроизводительного датчика лактата на весь срок службы под названием LiLac. Лактат является ключевым продуктом гликолиза, который недавно был оценен как основное клеточное топливо, циркулирующее в крови, средство передачи окислительно-восстановительного состояния между клетками и тканями и предпочтительное топливо для определенных типов рака18,19,20. Существующие биосенсоры лактата использовались для исследования метаболизма в головном мозге и раковых клетках21,22,23,24,25,26, но каждый из них имеет ограничения, которые затрудняют количественный анализ (например, слабая чувствительность к физиологическим изменениям лактата или нежелательные реакции на кальций). и/или pH). LiLac демонстрирует большой размер ответа (изменение времени жизни на 1,2 нс и изменение интенсивности> 40% в клетках млекопитающих), специфичность к физиологическому [лактату] и устойчивость к кальцию или изменениям pH. Более того, реакция времени жизни LiLac очень точна и не требует нормализации, что облегчает количественный анализ концентрации лактата в живых клетках. Таким образом, LiLac представляет собой мощный инструмент для изучения метаболизма на уровне отдельных клеток и демонстрирует преимущества нашего подхода к скринингу.

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

Блог